前置知識(shí)

ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）是一種常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，用于檢測(cè)和定量分析樣品中特定抗原或抗體的存在。ELISA是基于免疫學(xué)原理的一種高靈敏度和高特異性的實(shí)驗(yàn)方法。

ELISA實(shí)驗(yàn)通常包括以下步驟：

1.涂覆：將待檢測(cè)的抗原或抗體溶液加入到微孔板（通常是96孔板）中，并在孔板表面上形成一層

固定的抗原或抗體。這個(gè)過(guò)程被稱為涂覆。

2.阻斷：為了防止非特異性結(jié)合，需要在涂覆后加入一種阻斷劑，例如牛血清蛋白（BSA）或牛奶粉，以覆蓋孔板上未被固定的表面。阻斷劑可以減少非特異性結(jié)合和降低背景信號(hào)。

3.樣品加入：將待測(cè)樣品加入到微孔板中，樣品中的目標(biāo)抗原或抗體與固定在孔板上的抗體或抗原相互作用。

4. 洗滌：通過(guò)反復(fù)洗滌孔板，去除未結(jié)合的物質(zhì)，以減少背景信號(hào)

5. 探針加入：加入與待測(cè)物體特異性結(jié)合的酶標(biāo)記二抗（例如辣根過(guò)氧化物酶-HRP）或酶標(biāo)記抗原，使其與樣品中的目標(biāo)物體結(jié)合。

6. 洗滌：再次洗滌孔板，去除未結(jié)合的酶標(biāo)記物。

7. 底物加入：加入一種底物，其與酶標(biāo)記物相互作用，產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào)。常用的底物是一種可被酶催化產(chǎn)生顏色或熒光的物質(zhì)。

8. 反應(yīng)停止：通過(guò)加入一種停止劑，停止底物的反應(yīng)，阻止信號(hào)進(jìn)一步增加。

9. 信號(hào)測(cè)量：使用光譜儀或熒光測(cè)量?jī)x測(cè)量底物反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)，根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)確定樣品中目標(biāo)物體的濃度。

ELISA是分子生物學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究中常用到的實(shí)驗(yàn)操作之一，相信大家常常會(huì)有這樣那樣的實(shí)驗(yàn)問(wèn)題。

以下是同學(xué)匯總關(guān)于ELISA實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)空白背景高的常見(jiàn)原因和處理方法的經(jīng)驗(yàn)心得

問(wèn)題：ELISA空白背景高的常見(jiàn)原因和處理方法

通常陰性孔吸光光度值不會(huì)超過(guò)0.1。

常見(jiàn)原因有以下這些：

1）洗板不干凈

解決方法：

①充分洗滌：如果洗板的時(shí)間不夠，會(huì)導(dǎo)致抗體殘留，陰性對(duì)照會(huì)顯色，嘗試延長(zhǎng)洗板時(shí)間，增加洗板頻率，在洗液中添加表面活性劑Tween-20。

在洗板時(shí)要保證每步都全部洗滌，充分拍板直至孔內(nèi)沒(méi)有明顯的殘留液體。

②避免交叉污染：棄去洗液和孵育的抗體時(shí)避免交叉污染，移液槍頭盡可能一次性使用，拍板的濾紙不要反復(fù)使用。

2）顯色液變質(zhì)或者試劑過(guò)期

解決方法：檢查試劑盒有效期，或使用新的試劑盒并按照說(shuō)明書(shū)要求保存試劑盒。每次用剩下的顯色液最好不要回收，或者只回收洗凈的容器裝的顯色液。

3）試劑稀釋有誤，檢測(cè)抗體/酶結(jié)合物工作液濃度過(guò)高

解決方法：按照說(shuō)明書(shū)推薦的稀釋倍數(shù)稀釋抗體。

4）試劑盒組分未平衡

解決方法：試劑盒每個(gè)組分都需要平衡至室溫后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

5）混用其他試劑盒試劑

解決方法：保證使用試劑盒內(nèi)完整的一套試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同品牌及不同批次間的試劑可能存在不匹配現(xiàn)象，不同批號(hào)的試劑不要混用。

6）蒸餾水受酶等污染

解決方法：使用新鮮蒸餾水。

7）培養(yǎng)箱溫度超過(guò)37℃或反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)

解決方法：孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、溫度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加，從而造成本底增高。檢查恒溫箱，確保孵育溫度穩(wěn)定在37℃，按照說(shuō)明書(shū)的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行孵育。

8）酶標(biāo)板底部有污漬

解決方法：在加完終止液之后，檢測(cè)之前，用75%乙醇浸潤(rùn)的脫脂棉球擦拭酶標(biāo)板底部，確認(rèn)沒(méi)有污漬之后再檢測(cè)。

9）洗液被污染

解決方法：洗液現(xiàn)配現(xiàn)用，長(zhǎng)期放置會(huì)析出，也可能會(huì)污染，導(dǎo)致背景偏高。

10）包被的抗原被污染

解決辦法：仔細(xì)回想操作過(guò)程，換新的抗原包被。

11）封閉液、封閉時(shí)間、封閉液的濃度

解決辦法：封閉液（BSA）可能會(huì)與抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)。封閉液的濃度偏低、封閉時(shí)間過(guò)短導(dǎo)致部分封閉，抗體與酶標(biāo)板結(jié)合，可能也會(huì)導(dǎo)致背景偏高，因此可以適當(dāng)調(diào)整封閉液的濃度和時(shí)間以降低背景。

12）抗體質(zhì)量差或選擇的抗體不合適

解決辦法：抗體質(zhì)量不高，特異性不好可能會(huì)與封閉液（BSA）產(chǎn)生交叉反應(yīng)，可以用0.8%明膠（明膠不含有血清成分）代替。

若選擇多克隆抗體孵育，可能會(huì)與酶標(biāo)單抗產(chǎn)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致背景增加，最好選用與酶標(biāo)單抗同種屬的多克隆抗體。

13）酶標(biāo)儀設(shè)置參數(shù)有誤

解決辦法：檢查酶標(biāo)儀設(shè)置的波長(zhǎng)，不同波長(zhǎng)下樣品的吸光光度值也會(huì)有很大的差別，按照說(shuō)明書(shū)要求設(shè)置參數(shù)。

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