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    細胞轉(zhuǎn)染實驗技術——功能實驗的第一步

    發(fā)布時間： 2021-10-21　　點擊次數(shù)： 2189次

    轉(zhuǎn)染(transfection)是真核細胞主動或被動導入外源核酸片段（DNA或RNA）而獲得新的表型的過程。轉(zhuǎn)染后的細胞會產(chǎn)生重組蛋白，或者特異性的增強/抑制細胞中的基因表達。轉(zhuǎn)染后的檢測主要包括基因水平和蛋白水平的檢測。一定時間后收集轉(zhuǎn)染處理后的細胞，采用超聲或酶解的方法破碎細胞，離心得到上清。針對基因水平，使用普通 PCR 或 RT-PCR 進行驗證，蛋白水平，使用 western blot 檢測，簡單，快速，準確。

    細胞轉(zhuǎn)染實驗技術——功能實驗的第一步

    轉(zhuǎn)染的類型

    根據(jù)導入的核酸存在于宿主細胞的時間長短，可以分為瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn)。根據(jù)轉(zhuǎn)染方式可以分為化學方法，生物方法，物理方法。

    瞬時轉(zhuǎn)染是指將構建好的質(zhì)粒或者siRNA通過某種方式導入到哺乳動物細胞內(nèi)（常用的工具細胞 HEK293 細胞），該外源核酸片段不整合到細胞自身的基因組上。隨著細胞的生長分裂，外源基因會逐漸丟失，在細胞內(nèi)能夠存在 3-4 天，無法隨著細胞的分裂進入到子代細胞中。在這一段時間內(nèi)，外源基因在細胞內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)錄翻譯，得到少量的蛋白。根據(jù)使用的載體不同，收集目的基因/蛋白進行檢測的時間不同，通常在轉(zhuǎn)染后48h，目的蛋白的表達水平最高。瞬時轉(zhuǎn)染的特點是短時間內(nèi)進行蛋白的小量制備，滿足后續(xù)的實驗要求。

    穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是外源DNA整合到細胞基因組中，成為細胞基因組的一部分從而得以復制，隨著細胞分裂，子代細胞也同樣表達外源基因，這就是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的標志。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是建立在瞬時轉(zhuǎn)染的基礎上的，先對細胞進行轉(zhuǎn)染，再對得到的細胞池進行篩選，篩選標記是抗生素，熒光報告基團等，通常需要2-3周的篩選時間，由此形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的特點是能夠得到蛋白的大量、長期生產(chǎn)，滿足后續(xù)的一系列體內(nèi)體外的表型實驗。

    轉(zhuǎn)染方式

    考慮到轉(zhuǎn)染效率是影響細胞實驗的重要因素，因此選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染方式很關鍵。下面我們介紹一下常見的轉(zhuǎn)染方式。

    細胞轉(zhuǎn)染實驗技術——功能實驗的第一步

    細胞由帶負電荷的磷脂雙分子層構成，對于也帶負電荷的核酸片段（DNA和RNA）來說是不可透過的屏障，因此研究人員開發(fā)了很多方法能使核酸穿透細胞膜進入胞內(nèi)，大致分為三類：

    轉(zhuǎn)染方法

    原理

    優(yōu)點

    缺點

    化學轉(zhuǎn)染方法

    陽離子脂質(zhì)體

    脂質(zhì)體是一種人工的脂雙層膜。陽離子脂質(zhì)體通常由陽離子和兩性離子脂質(zhì)組成。在DNA與脂質(zhì)體形成lipoplex的過程中，陽離子脂質(zhì)體起到復合和凝集DNA的作用，同時也有助于復合物與細胞膜的結(jié)合

    操作簡單快速；

    轉(zhuǎn)染效率高且重復性好；

    可用于轉(zhuǎn)染DNA、RNA和蛋白；

    可用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

    會受到血清的抑制，降低轉(zhuǎn)染效率；

    脂質(zhì)體中的核心組分對細胞毒性較大

    磷酸鈣共沉淀

    核酸以磷酸鈣-DNA 共沉淀物的形式出現(xiàn)時，可使DNA 附在細胞表面，利于細胞吞入攝取，或通過細胞膜脂相收縮時裂開的空隙進入細胞內(nèi)

    便宜，使用廣泛

    轉(zhuǎn)染效率差，不穩(wěn)定；

    細胞毒性大；

    葡聚糖

    它是一種陽離子聚合物，可以與帶負電荷的DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合，進而被細胞吞噬

    多用于貼壁細胞

    一些細胞類型對葡聚糖特別敏感，可能會發(fā)生形態(tài)變化或者抑制細胞生長

    其他陽離子聚合物

    帶正電的聚合物與核酸帶負電的磷酸基團形成帶正電的復合物后與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，并通過內(nèi)吞作用進入細胞。陽離子聚合物和陽離子脂質(zhì)體最大的區(qū)別在于陽離子聚合物不含疏水部分而*溶于水，可以方便地進行化學修飾，且不會像脂質(zhì)體一樣破壞細胞結(jié)構，所以相對毒性較低。目前使用*泛的陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑是PEI（聚乙烯亞胺）

    成本低；

    免疫原性低；

    轉(zhuǎn)染效率高且穩(wěn)定；

    適用于懸浮細胞或貼壁細胞

     

     

    細胞毒性較大；

    常用于瞬時轉(zhuǎn)染；

    不能生物降解

    物理轉(zhuǎn)染方法

    電穿孔

    利用高脈沖電壓破壞細胞膜電位，使得DNA 通過膜上形成的小孔導入穩(wěn)定/瞬時性轉(zhuǎn)染

    適用所有細胞類型；

    適用瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；

    不需要載體

    需要一定的電轉(zhuǎn)設備；

    需要優(yōu)化電轉(zhuǎn)脈沖和電壓參數(shù)；

    細胞致死率高；

    DNA和細胞用量大

    顯微注射

    利用管尖極細（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細胞中

    適用所有細胞類型；

    可進行單細胞轉(zhuǎn)染；

    不需要載體；

    不限制轉(zhuǎn)入的基因大小和數(shù)量；

    多用于轉(zhuǎn)基因

    設備昂貴；

    技術要求高；

    細胞致死率高

    生物轉(zhuǎn)染方法

    病毒轉(zhuǎn)染

    病毒該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達

    轉(zhuǎn)染效率高；

    適用于難轉(zhuǎn)染的細胞系；

    可用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染

    周期長，程序復雜；

    費用相對高；

    存在生物安全問題

    細胞由帶負電荷的磷脂雙分子層構成，對于也帶負電荷的核酸片段（DNA和RNA）來說是不可透過的屏障，因此研究人員開發(fā)了很多方法能使核酸穿透細胞膜進入胞內(nèi)，大致分為三類：

    轉(zhuǎn)染的影響因素：

    轉(zhuǎn)染過程中許多因素會影響轉(zhuǎn)染效率：如細胞類型；細胞密度；質(zhì)粒大小、質(zhì)粒純度；血清；轉(zhuǎn)染試劑等。轉(zhuǎn)染實驗中，以下幾個因素進行調(diào)整和優(yōu)化：

    1. 轉(zhuǎn)染前的細胞狀態(tài)和密度

    轉(zhuǎn)染時細胞密度以 50-80%最佳，細胞密度過高會嚴重影響細胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率（周期進程阻滯，凋亡增加等）。同時支原體污染會嚴重降低細胞的轉(zhuǎn)染效率，因此轉(zhuǎn)染前可用環(huán)丙沙星處理細胞以除去支原體。

    2. 轉(zhuǎn)染時的質(zhì)粒純度

    如果提取的質(zhì)粒不純，如帶少量鹽離子，蛋白、代謝物污染等都會顯著影響轉(zhuǎn)染復合物的有效形成；而含有內(nèi)毒素的質(zhì)粒對細胞存在很大的毒性作用（一般用去內(nèi)毒素的提取試劑盒）。抗生素一般對真核細胞無毒，但轉(zhuǎn)染過程中細胞通透性增加，會使抗生素進入細胞，從而降低細胞活性，導致轉(zhuǎn)染效率降低。

    3. 轉(zhuǎn)染后的篩選時間

    轉(zhuǎn)染后篩選不能太早或太晚，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細胞代謝負荷大，增殖較慢，太晚會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細胞所淹沒，最終導致篩選不出陽性克隆。一般要在轉(zhuǎn)染后48h之后開始加抗生素篩選。

    4. DNA 與轉(zhuǎn)染試劑的比例

    許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化 DNA 與轉(zhuǎn)染試劑的比例。不同細胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，不同轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率差別很大，通常需要根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書進行預實驗，選擇合適濃度的外源DNA或RNA，調(diào)整外源核酸片段和轉(zhuǎn)染試劑的比例。


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