作用原理

高保真DNA聚合酶含有聚合中心和酶切中心[1]，聚合中心具有5’-3’聚合酶活性，負(fù)責(zé)聚合作用；酶切中心具有3’-5’外切酶活性（也稱校對(duì)活性），負(fù)責(zé)將不配對(duì)的核苷酸予以切除。

在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，當(dāng)引物與模板*互補(bǔ)后，進(jìn)入聚合中心，在聚合酶活性作用下，游離的脫氧核苷酸通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)原則，依次結(jié)合到引物的3’端，新鏈DNA從5’到3’進(jìn)行延伸（圖1-a）；當(dāng)引物末端結(jié)合的核苷酸與模板不配對(duì)時(shí)（圖1-b），錯(cuò)配的核苷酸會(huì)翹起，新鏈DNA無(wú)法繼續(xù)向前延伸，進(jìn)而進(jìn)入酶切中心，在外切酶活性作用下，錯(cuò)配的核苷酸會(huì)被切除（圖1-c）；切除后此位點(diǎn)會(huì)重新結(jié)合正確的核苷酸，新鏈DNA又能繼續(xù)從5’到3’進(jìn)行延伸（圖1-d），最終使新鏈DNA能夠進(jìn)行精準(zhǔn)復(fù)制[1-2]。

圖1. 高保真DNA聚合酶工作原理示意圖[1-2]

應(yīng)用方向

基因功能研究

案例：研究表明A基因可能參與擬南芥中花青素的代謝，為了驗(yàn)證這一假設(shè)，要先將A基因從擬南芥中擴(kuò)增出來(lái)，構(gòu)建到過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá)載體上，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入擬南芥中，使A基因在擬南芥體內(nèi)過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá)，最后通過(guò)形態(tài)指標(biāo)、生理指標(biāo)及基因表達(dá)水平等來(lái)判定這一假設(shè)是否成立。

基因測(cè)序

案例：若想探究擬南芥中B蛋白家族中不同基因的異同點(diǎn)，需要先將B蛋白家族中的所有基因從擬南芥中擴(kuò)增出來(lái)，得到這些基因的堿基序列，然后通過(guò)生物信息學(xué)分析來(lái)初步分析它們的異同點(diǎn)。

以上研究均需借助PCR技術(shù)將目的基因從物種中精準(zhǔn)擴(kuò)增出來(lái)，如果擴(kuò)增出的基因序列出現(xiàn)突變，那么后續(xù)分析都會(huì)不準(zhǔn)確；為了保證目的基因的精準(zhǔn)擴(kuò)增，我們?cè)赑CR擴(kuò)增過(guò)程中就需要使用高保真DNA聚合酶。

答：反應(yīng)體系：10 µl

①單酶：1 µl 10×Taq Buffer（MgCl2 Plus），0.5 µl dNTP Mix (10 mM)，0.2 µl Taq DNA Polymerase，1-7 µl純化后PCR片段，ddH2O補(bǔ)齊至10 µl

問(wèn)Q2：高保真酶DNA聚合酶擴(kuò)增的片段一定不會(huì)突變嗎？

答：高保真DNA聚合酶具有3’-5’的外切酶活性，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中可降低核苷酸錯(cuò)配的概率，保真度越高的DNA聚合酶，核苷酸錯(cuò)配的概率就會(huì)越低，但不表示擴(kuò)增過(guò)程中絕對(duì)不會(huì)發(fā)生核苷酸的錯(cuò)配。因此，為了提高實(shí)驗(yàn)的成功率，建議同一樣本挑取多個(gè)（>3個(gè)）單克隆進(jìn)行測(cè)序。

問(wèn)Q3：不同公司高保真DNA聚合酶的保真度有可比性嗎？

答：高保真酶的保真度通常表示為是Taq酶的幾倍，常見(jiàn)的保真度測(cè)定方法有：藍(lán)白斑篩選測(cè)定、一代測(cè)序和NGS測(cè)序等。不同品牌DNA聚合酶的保真度測(cè)定方法不同，若想要比較不同品牌DNA聚合酶的保真度，必須采用相同的保真度測(cè)定方法，進(jìn)行平行比對(duì)。

快速高保真酶推薦

參考文獻(xiàn):

[1] 黎景光. DNA聚合酶高保真原理應(yīng)用于SNP檢測(cè)的研究[D]. 暨南大學(xué), 2006.

[2] Steitz TA. DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms. J Biol Chem, 1999, 274(25): 17395–17398.