今天給大家分享一下在用磷酸化抗體做Western Blot時，應該注意些什么。

1.警惕內部敵人

一定要在 lysis buffer 中加入蛋白酶抑制劑，還要加入一定量的磷酸酶抑制劑，因為組織或細胞裂解時會釋放出大量磷酸化蛋白的死對頭——內源性蛋白磷酸酶，催化磷酸化蛋白(R-p)的去磷酸化，導致不同于正常生理狀態的差異。因此，外源性加入蛋白磷酸酶抑制劑，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，維護蛋白質的磷酸化狀態，否則即使 band 壓出來也會很淺，結果也不可信。

2.低溫能讓他們緊緊地擁抱對方

加一抗后最好 4 度過夜，低溫能讓抗體和目的蛋白緊緊地擁抱對方。為什么？因為蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附，高溫下容易脫落。膜上的抗原脫落了，結合效率會低。4 度也可使一抗重復使用多次。畢竟磷酸化的抗體都挺貴的。（土豪隨意）磷酸化的蛋白只占總的蛋白量的極少部分，就像聯誼舞會上讓來賓多相處一會產生 couple 的概率會大很多那樣，過夜可以保證抗體和蛋白有充分的結合時間。二抗則室溫 1 小時即可。

3.磷酸化抗體哪家強？

當然是 Cell signaling 公司。他家做的磷酸化抗體不錯，尤其是 MAPKs 磷酸化抗體。最好根據廠商的 protocol 來操作實驗，這是實驗成功的保證。

4．他們不宜“喝奶"

建議用含 5%BSA 的 TBST 稀釋 phospho-p38 等抗體，效果不錯，而不是用常見的含 5%nonfat milk 的 TBST。因為脫脂奶含磷酸化蛋白豐富，是奶中磷元素的來源之一。

5.如何避免磷化蛋白君和總蛋白君在膜上“打架"？

研究完某一蛋白的磷酸化情況后一般也要研究一下該蛋白總的表達量。但兩者的條帶位置一樣，怎么做？可以這樣：壓完磷酸化抗體后，把相同的 membrane 做 strip 后再壓總蛋白抗體,然后再 strip 一次，再壓內標 actin。

6.聽 marker 的，沒錯

做磷酸化蛋白 WB 時,除了目標蛋白的 band 以外,往往會出現非特異性的 band。磷酸化抗體 不好的話,甚至會壓出非特異性的 band,而沒有你想要的 band,所以壓片以后,一定要根據 markers 比對一下,你壓出的 band 分子量是否正確。

7.洗滌也大有學問

洗滌對最后的背景影響也較大，millipore 最近的說明書推薦用雙蒸水洗滌，效果很明顯，具體可以這樣：1st and 2nd 抗體之間，DDW 5min X3 次，2nd 抗體后，DDW 5min X3 次，TBST  5min X1 次，DDW rinse 3-4 次。對比 TBST 洗滌的 membrane，效果有一定差距，背景有效降低，即使壓片 30min，背景仍然是可以忽略的。